RNA:進化的第四維度

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細胞因子基因的檢測包括對其DNA的檢測和mRNA表達水平的檢測。特定細胞因子mRNA表達水平的檢測有助於判斷細胞表達該細胞因子的水平；而細胞因子DNA的檢測可以判斷該細胞因子基因存在與否及其變異情況。常用的方法有Southern印跡、斑點印跡、PCR，原位雜交及原位PCR等，Northern印跡及RT-PCR。這裡簡要介紹常見細胞因子mRNA表達水平的檢測。

一、斑點雜交法測定培養細胞IL-2 mRNA的含量

本法可用於基因組中特定基因及其表達產物的定性及半定量分析。該法先將RNA變性後直接點樣於硝酸纖維膜上，可用手工操作點樣，也可用斑點式點樣器點樣，再與特異性探針進行雜交。由於其操作比Northern印跡簡單、迅速、所需樣品量少，且可在同一張膜上同時進行多個樣品的檢測，故很適合於臨床應用。亦可用於DNA的檢測。但其缺點是不能鑑定所測基因的分子量。

下面以檢測培養細胞的IL-2 mRNA含量的檢測，說明斑點雜交法的操作過程。只要改變相應的DNA探針，此方法也適用與其他細胞因子mRNA含量的檢測；或者改變RNA的提取方法，也適用於其他類型細胞的檢測。

二、原位雜交法測定TNF的mRNA

RNA-DNA原位雜交的原理與分子雜交其它方法的原理相同。但是其它方法都是將RNA提取出來後進行分子雜交，而原位雜交則是在細胞內mRNA原有位置上進行雜交，細胞則盡可能保持原有形態。將細胞以適當方法固定後，除去脂類並適當消化細胞內的蛋白質，增大細胞對大分子物質的通透性，使DNA探針便於出入細胞。與免疫組化相結合，原位雜交可以將顯微鏡下的組織形態學資料與DNA，mRNA，蛋白質水平的基因活動聯繫起來。進行分子雜交之後，將玻片上細胞置與顯微鏡下觀察，可確定不同細胞內的基因表達定位情況。

三、反轉錄PCR(RT-PCR)定量檢測細胞因子的mRNA

細胞因子的mRNA壽命短且拷貝數低，因此難以在小量樣本中進行檢測。 RT-PCR?是一種能檢測細胞內低豐度特異RNA的方法，其原理是首先以R​​NA為模板，在逆轉錄酶的催化下，合成與RNA互補的cDNA。然後以cDNA為模板，用PCR技術對靶序列進行擴增，使微量細胞因子的RNA經放大後檢出。 RT-PCR能檢出單個細胞中少於10個拷貝的特異?RNA，如同時放大內參照物，即可對RT-PCR檢出的細胞因子mRNA進行定量。

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The ultimate goal of siRNA experiments is to assign gene function, analyze biological pathways, or validate potential drug targets. But before that goal can be realized, the siRNA has to be designed, synthesized, delivered to cells using an optimized protocol, and proven effective. Finally, it is necessary to correlate any induced phenotypic change with the extent of knockdown induced by the siRNA.

Ambion's Silencer ™ Pre-designed siRNAs for >34,000 human, mouse, and rat genes in the NCBI RefSeq database eliminate costly and time-consuming siRNA design, synthesis, and testing steps. Similarly, Applied Biosystems offers TaqMan® Gene Expression Assays for quantitative gene expression analysis of >41,000 human, mouse, and rat genes by real-time PCR. These assays can be used to measure mRNA knockdown for siRNA validation, to optimize transfection, and to correlate phenotype with the extent of knockdown induced by a particular siRNA.

Assays to Monitor Gene- specific siRNA Effects

siRNAs exert their effects at the mRNA level. Therefore, the preferred assay for siRNA validation and transfection optimization purposes is one that quantitates target mRNA levels. Once these preliminary studies are complete , there is an advantage to measuring both target mRNA and corresponding protein levels to correlate phenotypic changes–monitored by enzymatic assay, cell based assay, gene expression profiling, or other means–with extent of knockdown induced by an siRNA.

Advantages of TaqMan Gene Expression Assays

qRT-PCR provides several advantages for monitoring target mRNA levels in RNAi experiments. It is thousands of times more sensitive than Northern analysis, results can be obtained much more quickly (assays complete in only a few hours), and the method provides quantitative results. When used with Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays–off-the-shelf, pre-designed and pre-optimized primer-probe sets available for >21,000 human, >14,000 mouse, and >4,000 rat genes–the method requires no optimization. This makes real-time PCR easier to perform and the data obtained more reproducible with less signal variance than Northern analysis.

siRNA Validation

Gene silencing experiments require siRNAs that efficiently knock down expression of the target gene. To prove that a particular siRNA sequence is effective, the siRNA needs to be functionally tested in cells and be proven, or "validated," to reduce target mRNA levels by a predetermined amount. Functional testing of a large number of siRNAs designed using a particular siRNA design algorithm is also necessary to prove that the algorithm used to design the siRNA accurately predicts effective siRNAs.

Ambion, and partner Cenix BioScience, chose qRT-PCR to test Ambion's Silencer Validated siRNAs and to systematically validate more than 1100 siRNAs to verify the effectiveness of Cenix's siRNA design algorithm (this algorithm was used to design all of Ambion's Silencer Validated and Pre-designed siRNAs; see The Easiest Route to Guaranteed Silencing ). Using this method, siRNAs that are determined to reduce their target mRNA level by 70% or more are considered "validated" and are subsequently made available as Silencer Validated siRNAs.

The following procedure is used by both Cenix and Ambion to validate siRNAs:

1. Cells are plated in 96 well plates and grown for 24 hours.

2. Gene specific and negative control siRNAs are independently transfected in triplicate.

3. 48 hours later , RNA is extracted.

4. Target mRNA levels are quantitated by real-time PCR.

5. Data are normalized using 18S rRNA levels.

6. The extent of target gene knockdown is expressed as a percent of mRNA remaining in cells treated with the gene-specific siRNA

compared to cells treated with a negative control siRNA (Silencer Negative Control siRNA # 1).

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與rRNA和tRNA不同的是，哺乳動物細胞的絕大部分mRNA在其3'端均有一poly(A)尾，因此可以用oligo(dT)－纖維素親和層析法從大量的細胞RNA中分離mRNAdmonds等，1971;At Leder，1972）。在構建cDNA文庫時， 必須經上述純化步驟製備mRNA模板。

進行Northern雜交或Sl 核酸酶作用圖分析時，與總RNA相比，採用poly(A)+ RNA能獲得更為滿意的結果。可以按照Gilham(1964)所述方法製備Oligo(dT)－纖維素，也可以買現成的產品。

1. 用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g 0ligo(dT)－纖維素。

2. 將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱或裝入填有經用DEPC處理並經高壓滅菌的玻璃棉的

巴期德吸管中， 柱床體積為0.5-1.0ml，用3倍柱床體積滅菌水沖洗柱床。柱床體積為1m的oligo(dT)－纖維素最大量為10mg總RNA，如果總RNA的量較少，則應減少oligo(dT)－纖維素的使用量以防止poly(A)+RNA在過柱以及後續步驟中損失。

3. 用無菌的1x層析柱加樣緩衝液沖洗柱床直至流出液的pH值小於8.0。

1x層析柱加樣緩衝液：20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)；0.5mol/L NaCl；1mmol/L EDTA(pH8.0)；0.1%SDS

可按以下方法製備滅菌的層析柱加樣緩衝液；將適量無RNA酶的Tris. Cl(pH7.6)、氯化鈉和EDTA貯存液混合在15lbf/in2(1.034×10 ⁵ Pa)高壓下蒸氣滅菌，待其次序卻至65℃左右時加入已在65℃預熱30分鐘的10%SDS貯存液。也可以用0.05mol/L檸檬酸鈉代替Tris.Cl 然後用DEPC處理檸檬鈉－NaCL-EDTA和SDS的混合溶液。

4. 用滅菌水溶解RNA，於65℃溫育5分鐘後使迅速冷卻至室溫，加等體積的2x層析柱加樣緩衝液，上樣，立即用滅菌的試管收集洗液。當所的RNA溶液均進入柱床後，加1倍體積的1x層析柱加樣，繼續收集洗出液。加熱RNA可以破壞可能涉及poly(A)尾的二級結構。

5. 當全部溶液流出後，將收集液置於65℃溫育5分鐘，重新上樣，並收集流出液。

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RNA的提取準備試劑：氯仿，異丙醇，75%乙醇，無RNase的水或0.5%SDS(溶液均需用DEPC處理過的水配製)

操作步驟：

1. 勻漿處理：

① 組織將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入1ml TRIzol，用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10%。

② 單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm²面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。 TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決於細胞數。 TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

③ 細胞懸液離心收集細胞，每5-10×10⁶ 動物、植物、酵母細胞或1×10⁷細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2. 將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白複合物完全分離。

3. 可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多醣或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可於2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉澱中包括細胞外膜，多醣，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振盪15秒，室溫放置3分鐘。

5. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。 RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60%。

6. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見後。用異丙醇沉澱水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

7. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉澱，離心後在管側和管底出現膠狀沉澱。移去上清。

8. 用75%乙醇洗滌RNA沉澱。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75%乙醇。 2-8℃不超過7500×g離心5​​分鐘，棄上清。

9. 室溫放置乾燥或真空抽乾RNA沉澱，大約晾5-10分鐘即可。不要真空離心乾燥，過於乾燥會導致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl無RNase的水或0.5%SDS，用槍頭吸打幾次，55-60℃放置10分鐘使RNA溶解。如RNA用於酶切反應，勿使用SDS溶液。 RNA也可用100%的去離子甲酰胺溶解，-70℃保存。

注意事項：

1.從少量樣品（1-10mg組織或10²-10⁴ 細胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進RNA沉澱。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉澱RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原會與RNA一同沉澱出來，糖原濃度不高於4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應。

2．勻漿後加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個月。 RNA沉澱可以保存於75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

3．分層和RNA沉澱時也可使用台式離心機，2600×g離心30-60分鐘。

預期產量：1mg組織或1×10⁶細胞提取RNA分別為：

肝和脾6-10μg，腎3-4&mu ;g，骨骼肌和腦組織1-1.5μg，胎盤1-4μg，上皮細胞8-15μg，成纖維細胞5-7μg 。

常見問題分析：

1. 得率低：

① 樣品裂解或勻漿處理不徹底

② RNA沉澱未完全溶解

A260/A280<1.65 ：

① 檢測吸光度時，RNA樣品沒有溶於水，而溶於了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高

②  樣品勻漿時加的試劑量太少

③ 勻漿樣品時未在室溫放置5分鐘

④ 吸取水相時混入了有機相

⑤ RNA沉澱未完全溶解。

RNA降解：

① 組織取出後沒有馬上處理或冷凍

②  待提取RNA的樣品沒有保存於-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃

③ 細胞在用胰酶處理時過度

④ 溶液或離心管未經RNase去除處理

⑤ 電泳時使用的甲醛pH值低於了3.5

DNA污染：

① 樣品勻漿時加的試劑量太少

②  樣品中含有有機溶劑(如乙醇，DMSO等)，強緩衝液或鹼性溶液

蛋白聚醣和多醣污染：沉澱RNA的過程中作以下改進可去除這些污染，步驟7中，每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml異丙醇和0.25ml高鹽溶液(0.8M檸檬酸鈉和1.2M NaCl)混合離心，按之前操作進行。這種方法可使蛋白聚醣和多醣留在溶液中，高效沉澱出純RNA。從含有大量多醣的植物中提取RNA時應在勻漿後離心，並加上以上操作步驟。

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在所有RNA實驗中，最關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由於RNA酶廣泛存在而穩定，一般反應不需要輔助因子。因而RNA製劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在製備與分析過程中的降解，而所製備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結果，所以RNA的製備與分析操作難度極大。

在實驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內源性的RNA酶。 RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。

外源性的RNA酶存在於操作人員的手汗、唾液等，也可存在於灰塵中。在其它分子生物學實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃製品、塑料製品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細胞中則含有大量內源性的RNA酶。

一、 防止RNA酶污染的措施

1.   所有的玻璃器皿均應在使用前於180℃的高溫下幹烤6hr或更長時間。

2.   塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。

3.   有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇乾燥，再浸泡在3%H₂ O₂室溫10min，然後用0.1%DEPC水沖洗，晾乾。

4.   配製的溶液應盡可能的用0.1%DEPC，在37℃處理12hr以上。然後用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配製，然後經0.22μm濾膜過濾除菌。

5.   操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。

6.   設置RNA操作專用實驗室，所有器械等應為專用。

二、常用的RNA酶抑製劑

1.  焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑製劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。

2.  異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑製劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。

3.  氧釩核糖核苷複合物：由氧化釩離子和核苷形成的複合物，它和RNA酶結合形成過渡態類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。

4.  RNA酶的蛋白抑製劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。 RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑製劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。

5.  其它：SDS、尿素、矽藻土等對RNA酶也有一定抑製作用。

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實驗目的

從黃化小麥苗中提取總RNA，可以為cDNA文庫的構建做好準備。我們重點是要保證RNA的完整性、產率、防止修飾和純度，尤其是完整性、防止修飾和純度。 RNA是單鏈，2’OH是它的化學性質遠比DNA活潑。所以，提取RNA頗為不易。加之RNA的不均一性，要將所有的RNA（rRNA、tRNA、mRNA）完全提出，更加有挑戰性。而Rnase是無處不在的（這種酶遇高溫後也不會喪失活性，复性容易，在胞內外都有分佈，不需激活，不需要二價金屬離子的配合）；RNA還最怕DNA污染，因為若做RT-PCR，DNA的存在會降低產物的純度和效率所有以上的因素都構成了我們成功提取RNA的障礙。但是我們可以不用考慮RNA的機械剪切，因為RNA通常較小，一般不會受到機械剪切的影響。

實驗原理及過程

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從植物組織中提取RNA是進行植物分子生物學方面研究的必要前提。要進行Northern雜交分析，純化mRNA以用於體外翻譯或建立cDNA文庫，RT-PCR及差示分析等分子生物學研究，都需要高質量的RNA。因此，從植物組織中提取純度高、完整性好的RNA是順利進行上述研究的關鍵所在。

從文獻報導上看，有許多植物就是由於未能有效地分離純化其組織中的RNA，而阻礙了其分子生物學方面研究的進展。一般認為在這些植物組織中，或富含酚類化合物，或富含多醣，或含有某些尚無法確定的次級代謝產物，或RNase的活性較高。在完整的細胞內這些物質在空間上與核酸是分離的，但當組織被研磨，細胞破碎後，這些物質就會與RNA相互作用。酚類化合物被氧化後會與RNA不可逆地結合，導致RNA活性喪失及在用苯酚、氯仿抽提時RNA的丟失，或形成不溶性複合物；而多​​醣會形成難溶的膠狀物，與RNA共沉澱下來；萜類化合物和RNase會分別造成RNA的化學降解和酶解。

對於這些植物材料，用常規的RNA提取方法（如胍法、苯酚法和十六烷基三甲基溴化胺法等）難以提取出其RNA。如Lбpez-Gбmez等在用常規的方法提取芒果果實的RNA時未能成功，他們的結果分為三種情況：提出的RNA已被降解；RNA的得率很低；得到的RNA不能進行體外翻譯。他們認為在果實成熟時各種酶的活性增強，其中也包含RNase，不溶性的澱粉轉化為可溶性的多醣，芒果果實細胞壁中特殊的成份，以及果實中高含量的多酚化合物都是乾擾RNA提取的因素。 Tesniere等在用苯酚法和胍法提取葡萄果實的RNA時，發現RNA與某種未知化合物凝聚成不溶性的複合物，並且這種未知化合物在230nm和270nm處有強的光吸收，從而乾擾了RNA紫外吸收的測定。因此能否有效地去除多醣、酚類化合物、RNase和乾擾RNA提取的其它代謝產物是提取高質量植物RNA成敗的關鍵。本文根據文獻綜述了解決上述植物RNA提取過程中難點的相應對策。

1. 防止酚類化合物的干擾

許多植物組織特別是植物的果實（如蘋果、櫻桃、李子、葡萄等）和樹木類植物中富含酚類化合物。酚類物質的含量會隨著植物的生長而增加。因而從幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，針葉類植物的針葉中多酚的含量比在落葉植物的葉子中要高得多。在植物材料勻漿時，酚類物質會釋放出來，氧化後使勻漿液變為褐色，並隨氧化程度的增加而加深，這一現像被稱為褐化效應（browningeffect）。被氧化的酚類化合物（如醌類）能與RNA穩定地結合，從而影響RNA的分離純化。但Newbury等發現RNA提取的難易程度與材料中酚類物質的總量之間並無相關性，因此認為不是所有的酚類化合物都影響RNA的提取。但一般認為所謂的“縮合鞣質”即聚合多羥基黃酮醇類物質（如原花色素類物質）是影響RNA提取的一類化合物。目前去除酚類化合物的一般途徑是在提取的初始階段防止其被氧化，然後再將其與RNA分開。

① 防止酚類化合物被氧化

還原劑法：一般在提取緩衝液中加入(-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（ DTT）或半胱氨酸來防止酚類物質被氧化，有時提取液中(-巰基乙醇的濃度可高達2％。(-巰基乙醇等還可以打斷多酚氧化酶的二硫鍵而使之失活。Su等認為在過夜沉澱RNA時加入(-巰基乙醇（終濃度1％）可以防止在此過程中酚類化合物的氧化。硼氫化鈉（NaBH₄）是一種可還原醌的還原劑，用它處理後提取緩衝液的褐色可被消減，醌類化合物可被還原成多酚化合物。

螯合劑法：螯合劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP ）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO－N＝基有很強的結合多酚化合物的能力，其結合能力隨著多酚化合物中芳環羥基數量的增加而加強。原花色素類物質中含有許多芳環上的羥基，因而可以與PVP或不溶性的PVPP形成穩定的複合物，使原花色素類物質不能成為多酚氧化酶的底物而被氧化，並可以在以後的抽提步驟中被除去。用PVP去除多酚時pH值是一個重要的影響因素，在pH8.0以上時PVP結合多酚的能力會迅速降低。當原花色素類物質量較大時，單獨使用PVPP無法去除所有的這類化合物，因而需要與其它方法結合使用。

Tris-硼酸法：如果提取緩衝液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以與酚類化合物依*氫鍵形成複合物，從而抑制了酚類物質的氧化及其與RNA的結合。這一方法十分有效，所以Lбpez-Gбmez等在提取緩衝液中不再加入其它還原劑。但如果Tris-硼酸濃度過高（＞0.2M）則會影響RNA的回收率。

牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素類物質與BSA間可產生類似於抗原－抗體間的相互作用，形成可溶性的或不溶性的複合物，減小了原花色素類物質與RNA結合的機會，因此提高了RNA的產量。BSA與PVPP結合使用提取效果會更好。由於BSA中往往含有RNase，因而在使用時要加入肝素以抑制RNase的活性。

丙酮法：Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷凍研磨後的植物材料，可以有效地從雲杉、松樹、山毛櫸等富含酚類化合物的植物材料中分離到高質量的RNA。

Guillemant等和Ainsworth認為低pH值（pH5.5）的提取緩衝液可以防止酚類化合物的離子化和進一步的氧化。

② 酚類化合物的去除

通過Li⁺或Ca ²⁺沉澱RNA的方法可以將未被氧化的酚類化合物去除。與PVP、不溶性PVPP或BSA結合的多酚，可以直接通過離心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提時除去。Manning利用高濃度的2-丁氧乙醇（50％）來沉澱RNA，而多酚溶解於2-丁​​氧乙醇中而被除去。然後用含50％2-丁氧乙醇的緩衝液洗滌RNA沉澱以去除殘留的多酚。他認為即使多酚被氧化，其氧化產物仍可以溶解在高濃度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，無需再用NaBH4來處理。

2. 防止多醣的干擾

多醣的污染是提取植物RNA時常遇到的另一個棘手的問題。植物組織中往往富含多醣，而多醣的許多理化性質與RNA很相似，因此很難將它們分開。在去除多醣的同時RNA也被裹攜走了，造成RNA產量的減少；而在沉澱RNA時，也產生多醣的凝膠狀沉澱，這種含有多醣的RNA沉澱難溶於水，或溶解後產生粘稠狀的溶液。由於多醣可以抑制許多酶的活性，因此污染了多醣的RNA樣品無法用於進一步的分子生物學研究。在常規的方法中，通過SDS-鹽酸胍處理可以部分去除一些多醣；在高濃度Na⁺或K⁺離子存在條件下，通過苯酚、氯仿抽提可以除去一些多醣；通過LiCl沉澱RNA也可以將部分多醣留在上清液中。但即使通過這些步驟仍會發現有相當多的多醣與RNA混雜在一起，所以還需要用更有效的方法來解決植物RNA分離純化時多醣污染的問題。

用低濃度乙醇沉澱多醣是一個去除多醣效果較好的方法。在RNA提取液或溶液中緩慢加入無水乙醇至終濃度10％～30％，可以使多醣沉澱下來，而RNA仍保留於溶液中。一般都是在植物材料的勻漿液中加入乙醇，如Lewinsohn等在從裸子植物的木質莖中提取RNA時，在勻漿上清液中加入乙醇至終濃度10％以沉澱多醣。但Tesniere等在從葡萄漿果組織中提取RNA時，是在用CsCl超離心，乙醇沉澱之後的RNA溶液中加入終濃度30％乙醇來沉澱多醣的，進一步純化了RNA樣品。

另一個常用的方法是醋酸鉀沉澱多醣法。Bahloul等在提取雲杉組織的RNA時在勻漿上清液中加入1/ 3體積的5M醋酸鉀（pH4.8）溶液以沉澱多醣；Ainsworth在提取酸模植物花組織的RNA時加入的是1/5體積的5M醋酸鉀（pH4.8）溶液。Hughes等在提取棉花葉和花粉的RNA時是加1/3體積的8.5M醋酸鉀（pH6.5）溶液到勻漿液中以除去多醣等雜質。在提取某些植物材料的RNA時，是將上述兩種方法結合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA時，是在勻漿液中加入0.25體積的無水乙醇和0.11體積的5M醋酸鉀溶液以去除多醣雜質。Su等在去除褐藻的多醣時，單獨使用乙醇或醋酸鉀都無效，只有兩者結合使用效果最佳。

Fang等認為緩衝液中含有高濃度的NaCl有助於去除多醣。Chang等在提取松樹RNA時，緩衝液中NaCl的濃度為2.0M和1.0M，通過氯仿抽提和乙醇沉澱RNA將R​​NA與多醣分離。Manning是將胡蘿蔔種子等材料苯酚提取後的上清液稀釋，調節Na⁺離子濃度至80mM，然後加入0.4體積的2-丁氧乙醇來沉澱去除多醣。

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採用Promega公司的PolyATract® 26reg；mRNA Isolation System III。

使用該試劑盒，mRNA產量極低，因此下述方法是以Promega公司試劑盒操作手冊為基礎，並採用儲昭暉碩士（作物遺傳改良國家重點實驗室植物分子生物學水稻分室）所建議的改進方法綜合而成。

由使用者自備的材料
       65℃水浴
        無菌的、無RNase的1.5ml塑料離心管
       無菌的、無RNase的加樣槍和槍頭

操作步驟

1. 探針的退火

① 在一個無菌的、無RNase的離心管中，加入未稀釋的總RNA溶液，使終體積達到1.5ml。可使用更大量的總RNA，其濃度可至過飽和，即有絮狀RNA沉澱析出，但當有絮狀RNA沉澱存在時，後續的退火反應操作會受到一定程度影響；也可使用更少量的總RNA（50ug），但mRNA產量可能無法保證。

② 將離心管置於65℃水浴中10分鐘或略長時間。

③ 加入15ul 的Biotinylated-Oligo（dT）探針和39ul的20%&times ;SSC到RNA中。顛倒數次以混勻，靜置於室溫下至充分冷卻。這將需要10分鐘或略少的時間。在該溶液冷卻期間，製備0.5%× 和0.1%×SSC貯存液

2. 貯存液製備

① 通過在三個無菌的、無RNase的離心管中各自混合30ul的20%&times ;SSC和1.170ml的無RNase的水來製備三份1.2ml的無菌的0.5%×SSC。

② 通過在三個無菌的、無RNase的離心管中各自混合7ul的20%×SSC和1.393ml的無RNase的水來製備三份1.4ml的無菌的0.1%×SSC。

3. 鏈黴抗生物素蛋白-磁珠（Streptavidin-Paramagnetic Particles）的漂洗

① 取三管鏈黴抗生物素蛋白-磁珠，輕彈離心管的底部使SA-PMPs重懸直至其充分分散，吸取懸液合併於一管。

② 使匯總的SA-PMPs重懸直至其充分分散，然後將離心管置於磁柱中直至SA-PMPs已經聚集在離心管壁上（大約30秒）。小心地移出上清。不要離心沉澱顆粒。

③ 用0.5%× SSC漂洗SA-PMPs三次（每次0.9ml），每次都使用磁柱來捕獲它們，然後小心地移去上清。

4）重懸漂洗過的SA-PMPs於0.3ml的0.5%× SSC中。

4. Oligo（dT）-mRNA退火雜合體的捕獲和漂洗

① 將退火反應的全部成分加入到含有漂洗過的SA -PMPs的離心管中。

② 室溫下靜置10分鐘。每1-2分鐘輕柔地顛倒一次以混勻。

③ 用磁柱捕獲SA-PMPs，小心移去上清，注意不要攪動SA-PMPs顆粒。當總RNA為過飽和高濃度時溶液時，退火反應易形成黑色絮狀物，磁柱吸附也難以壓縮其體積，這時應小心吸取上清；保留上清直至確信mRNA的結合與洗脫已是令人滿意。

④ 用0.1%×SSC（每次0.9ml）漂洗顆粒4次，其間輕彈離心管底部直至顆粒已被重懸。最後一次漂洗後，在不攪動SA-PMPs的前提下，以8000rpm離心1分鐘，盡可能多地移出液相。

5.mRNA的洗脫

① 為洗脫mRNA，將最終的SA-PMPs重懸於0.1ml的無RNase的水中，溫柔地輕彈離心管以重懸顆粒。

② 65℃水浴2分鐘。

③ 用磁場捕獲SA-PMPs，8000rpm離心30秒。

④ 將含有洗脫的mRNA的液相移入一無菌的、無RNase的離心管中。勿將顆粒丟棄。

⑤ 重懸SA-PMP顆粒於0.15ml的無RNase的水中，65℃水浴2分鐘，用磁場捕獲SA-PMPs，8000rpm離心2分鐘。將洗脫液與5. ④ 步驟中洗脫的mRNA合併。

⑥ 如果這時有任何顆粒也被攜帶到終溶液中，可用10,000×g，4℃，5-10分鐘的離心來去除。小心地將RNA轉入一新鮮的無RNase的離心管中。

6.mRNA的濃縮

① 加入等體積異丙醇，混勻。通常立刻有肉眼可見之沉澱生成，立即以12000rpm離心10分鐘，沉澱mRNA。或根據沉澱生成的難易，-20℃放置數小時或過夜再沉澱。

② 小心倒去異丙醇，加75%乙醇洗滌。

③ 小心倒去75%乙醇，室溫乾燥。

④ 將mRNA溶於20ul無RNase的水中。注意管壁上通常會粘附大量mRNA沉澱，用槍頭吸取水滴在管壁上滾動數次以盡可能回收mRNA。

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1. 對每個基因設計並檢測兩到四個siRNA序列

為了找到潛在靶位點，掃描靶基因中的AA序列。記錄每個AA 3’端19個核苷酸作為潛在siRNA靶位點。潛在靶位點需通過GENBANK數據庫的BLAST分析，去除那些與其它基因明顯同源的靶位點。如果可能，siRNA應根據mRNA低二級結構的區域設計。

2. 選擇低GC含量的siRNA

Ambion公司研究發現GC含量在40-55%的siRNA比55%以上的活性高。

3. 純化體外轉錄siRNA

在轉染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結合，洗脫(Ambion siRNA體外合成試劑盒中已包括純化柱保證siRNA純度)或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應中多餘的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學合成的RNA通常需要跑膠電泳純化(即PAGE膠純化)。

4. 避免RNA酶污染

微量的RNA酶將導致siRNA實驗失敗。由於實驗環境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭髮，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品…因此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。 Ambion公司在這方面有一整套的產品線，如除RNA酶的噴劑，拭紙及​​液劑，檢測和去除RNA酶。

5. 健康的細胞培養物和嚴格的操作確保轉染的重複性

通常，健康的細胞轉染效率較高。此外，較低的傳代數能確保每次實驗所用細胞的穩定性。為了優化實驗，推薦用50代以下的轉染細胞，否則細胞轉染效率會隨時間明顯下降。

6. 避免適用抗生素

Ambion公司推薦從細胞種植到轉染後72小時期間避免使用抗生素。抗生素會在穿透的細胞中積累毒素。有些細胞和轉染試劑在siRNA轉染時需要無血清的條件。這種情況下，可同時用正常培養基和無血清培養基做對比實驗，以得到最佳轉染效果。 QIAGEN推出的專門針對RNA轉染的試劑

7. 選擇好的轉染試劑轉染siRNA

針對靶細胞類型，選擇好的轉染試劑和優化的操作對siRNA實驗的成功至關重要。 siRNA實驗要求選擇適合轉小的RNA的轉染試劑(目前大多數轉染試劑都針對轉染比較大的質粒DNA，而非小的RNA分子，宿主範圍大小也不同)。 Ambion公司的Silencer siRNA Transfection Kit，QIAGEN的Transmessenger Transfection Reagent都是專門針對轉siRNA優化的轉染試劑，是您的理想選擇。

8. 通過合適的陽性對照優化轉染和檢測條件

對大多數細胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉入靶細胞(同樣適合實驗靶siRNA)，轉染48小時後統計對照蛋白或mRNA相對於未轉染細胞的降低水平。過多的siRNA將導致細胞毒性以至死亡。 Ambion公司提供多種靶基因的陽性siRNA。

9. 通過陰性對照siRNA排除非特異性影響

合適的陰性對照可通過打亂活性siRNA的核苷酸順序設計而得。必須注意它要進行同源比較確保相對所要研究的生物的基因組沒有同源性。

10. 通過標記siRNA來優化實驗

熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩定性和轉染效率。標記的siRNA還可用作siRNA胞內定位及雙標記實驗(配合標記抗體)來追踪轉染過程中導入了siRNA的細胞，將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。

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